KRIOPRESERVASI DARI IRISAN HIPPOCAMPAL TIKUS DENGAN VITRIFIKASI

KRIOPRESERVASI DARI IRISAN HIPPOCAMPAL TIKUS DENGAN VITRIFIKASI

By : Taufiq Hidayat

Abstrak 

Walaupun banyak hal yang menarik dan dihadirkan oleh kriopreservasi, memiliki neuron yang belum dewasa untuk kemudian digunakan dalam kultur jaringan secara pencangkokan (terapeutik intracerebral),  tidak ada laporan pada kriopreservasi dewasa yang berpotensi diorganisir oleh irisan  jaringan otak  untuk pengembangan obat-obatan farmasi. Kami melaporkan disini bahwa  percobaan pertama yang jatuh tempo pada kriopreservasi  tikus  hippocampal diiris melintang. Pembekuan pada 1,2^o C hingga menit 20 ^o C atau di bawah 10 atau 30% v / v gliserin atau 20% v / v dimethyl  sulfoxide menghasilkan hasil yang sangat miskin. Irisan hippocampal juga pesat terdeteksi oleh terkena suhu rendah 0^oC di cairan otak (aCSF). Ini adalah efek yang disebut mitigated dengan vitamin C 0,8 mm, penggunaan  yang berlebih pada intracellular versi aCSF mengalami penurunan sodium dan calcium dan potassium tingkat tinggi, dan  kehadiran 25% w/v campuran dimethyl sulfoxide, formamide, dan ethylene glycol (Veg solutes,Cryobiology 48, pp.  22-35, 2004). Ia tidak mitigated oleh gliserin, aspirin, indomethacin, atau mannitol Selain aCSF. Ketika RPS-2 (Cryobiology 21, pp. 260-273, 1984) digunakan sebagai salah satu solusi untuk panduan hingga 50% w/v Veg solutes, 0^o C memiliki perlindungan lebih dari 10 ^oC. Veg meningkatkan konsentrasi sampai 53% w/v dilakukan pengirisan dengan vitrifikasi tanpa cedera dari vitrifikasi dan rewarming  per se, tetapi lebih baik daripada merusak campuran 50% w/v Veg. Mengatasi masalah ini adalah dengan menggunakan   61% w/v VM3 yang serasi dengan larutan vitrifikasi (Cryobiology 48, pp. 157-178, 2004) berisi polyvinylpyrrolidone dan dua extracellular es balok. Dengan VM3, ia hanya mungkin untuk mencapai suatu jaringan K+/Na+ rasio setelah vitrifikasi dengan jarak yang dimulai dari 91 sampai 108%  yang diperoleh dengan kontrol tanpa irisan. Pemeriksaan mikroskopis menunjukkan kerusakan parah di bagian pembekuan irisan, tetapi umumnya sangat baik untuk ultrastructural dan pelestarian histologik setelah vitrifikasi. Kami memberikan hasil demonstrasi pertama yang baik kelangsungan hidup dan struktur disusun matang, kompleks dengan saraf jaringan yang baik  diawetkan dengan proses vitrifikasi. Hasil di bulan Mei pada neuropsychiatric membantu obat  dan evaluasi pembangunan transplantasi  terpadu dari otak ke daerah otak benar mengalami penyakit atau luka.

Kata Kunci: Hippocampal; Hippocampi; tikus; irisan otak; transplantasi otak; luka menakuntukan; Storage; agen krioprotektif; es bebas;  penemuan obat; seleksi obat; Neuropharmaceutical; Hypothermia; Hypothermic; peredaran darah penangkapan; ischemia dingin.

Dengan saraf yang di kriopreservasi dari sistem kompleks yang berbeda-beda telah dilaporkan secara menyeluruh atas  selama beberapa dekade.  Studi ini telah didorong oleh berbagai  terapan penting, investigasi, dan tujuan praktis. Namun, mengherankan, tujuan menggunakan kriopreservasi dengan sistem jaringan saraf untuk neuropharmacological  seleksi obat tampaknya tidak diikuti. Kelayakan melestarikan pharmaceutically yang relevan dengan fungsi dalam Synaptic kriopreservasi dengan saraf sirkuit yang diusulkan oleh laporan lengkap klasik Pascoe  dari pemulihan  tikus unggul cervical pusat, termasuk demonstrasi  unaltered dari Synaptic transmisi, berikut  relatif cepat untuk pendinginan76 ^oC [40], namun tidak sebanding dengan demonstrasi yang tersedia untuk ditetapkan pada  sel-sel otak. Kompleks saraf berfungsi kembali setelah pembekuan jaringan ke otak relatif  pada suhu tinggi subzero, namun tidak setelah  pendinginan ke suhu yang diizinkan pada penyimpanan jangka panjang. Irisan hippocampal yang baik adalah belajar wellcharacterized dan mudah-model diuji trisynaptic  pada jalan yang telah digunakan untuk penyeleksian di berbagai agen pharmasi. Jensen dan kolega melaporkan keberhasilan kriopreservasi hippocampi tikus yang belum dewasa, karena dinilai  terutama dari mereka hidup dan integrasi dengan jaringan berikut intracerebral pencangkukan. Meskipun studi mereka adalah untuk mendorong  penggunaan teknik transplantasi jaringan otak,  mereka tidak bertujuan untuk menyediakan jaringan dewasa neuropharmacological penyeleksi obat dan penggunaan  jaringan yang belum dewasa, yang mungkin berbeda dari jaringan dewasa  baik di kriopreservasi maupun kemudahan dalam pharmacological  responsif, umumnya tidak berlaku untuk tujuan tersebut. Isolasi Kriopreservasi dari ketuban hippocampal sel telah dilaporkan  tetapi, di samping dari latar belakang ketidakdewasaan  untuk penemuan obat, sel ini tidak dapat menyimpulkan  semua hubungan yang utuh hippocampal  jaringan dan dapat diubah oleh prosedur isolasi  dan kurangnya kontak yang sesuai dengan sel lainnya.

Model irisan otak yang secara luas digunakan oleh industri farmasi. Itu memiliki kemampuan mengumpul semangat sepenuhnya dan fungsi normal jaringan iris untuk pharmasi evaluasi metabolisme obat, racun, dan respon molekular yang dipilih dan fisiologis sasaran  obat ke dalam pembangunan dan akan memungkinkan perusahaan farmasi untuk lebih nyaman  dalam jadwal percobaan, lebih mudah dilakukan evaluasi serentak pada spesies dan banyak lagi mudah dilakukan pemeriksaan serentak dari metabolisme obat dalam beberapa organ dari sistem  yang sama jenis sambil mengurangi ketergantungan di rumah jaringan dan pemrosesan vivarium yang digunakan. Seharusnya ini juga mengizinkan membeli sporadis  sel-sel semangat manusia agar lebih banyak tersedia untuk pengujian kapan dan di mana diperlukan. Untuk mengatasi kekurangan menunjukkan keberhasilan dalam melestarikan fungsi sistem terpadu dewasa dengan saraf farmasi untuk penemuan obat-obatan, kami berusaha untuk menentukan apakah tikus malang hippocampal dengan irisan berikut dapat tetap bersemangat setelah kriopreservasi oleh salah satu atau pembekuan vitrifikasi. Hasil kami menunjukkan bahwa pembekuan walaupun telah sangat merusak  tikus ke irisan hippocampal, vitrifikasi struktural diizinkan dengan integritas dan kelangsungan hidup ini persiapan untuk menjadi sangat baik diawetkan. 

Materi dan metode

Persiapan Irisan  Otak

Semua prosedur dilakukan pada tikus dengan persetujuan dari Harbor-UCLA Animal  Gunakan perawatan dan Komite dan sesuai dengan pedoman USDA. Tikus jantan Wistar dengan berat 220-320 g yang peroleh makanan dan air untuk 18-20 hari sebelum percobaan. Mereka  mati rasa dengan isoflurane di ruang tertutup,  beratnya ditransfer ke dalam air es dangkal  yang kedua ruang tertutup juga berisi isoflurane. Setelah 7-9 menit dari pra-pendinginan, tikus yang telah dilakukan pendinginan dari ruangan dan segera dimatikanbdengan alat pemenggal kepala. Otaknya telah didinginkan di bawah  dingin saline dalam 1-1,5 menit dan ditransfer ke sebuah piala dari buatan cairan otak (aCSF) dengan suhu 0-2 ^oC selama 1 menit. (Komposisi dari aCSF adalah: 124 mm NaCl, KCl 5 mm, 22 mm NaHCO3, 1,25 mm NaH2PO4, 1,25 mm MgSO4, 2mm CaCl2 dan 10 mm glukosa.) pH yang telah diatur yakni 7,4 dan dikelola dengan 95% O₂ / 5% CO₂. bagian kanan hippocampal dihilangkan dan disimpan dalam aCSF pada piala bersuhu 0-2 ^oC sedangkan bagian kirinya dihilangkan pula. Setiap persiapan hippocampal telah dipotong menjadi delapan sampai sembilan tebal 475 lm iris melintang menggunakan jaringan McIlwain chopper. Yang telah iris  dihilangkan dari blade yang menggunakan parang sikat warna lunak hitam dan ditransfer ke campuran yang mengandung  aCSF dengan suhu 4-6 ^oC. Akhirnya, semua irisan telah dipindahkan ke duanya dari sebuah Oslo-jenis ruang rekaman (Fine Sains Tools, Foster City, CA, USA) dan  inkubasi dengan aCSF dengan suhu 34-37^o C selama sedikitnya 1 jam sebelum digunakan dalam percobaan. Total waktu  diperlukan untuk persiapan irisan selama 9,5-11 min. Volume masing-masing irisan baik dari ruang Oslo  adalah 2 ml. Irisan yang telah di superfused dengan aCSF 1,2-6 ml / menit untuk perendaman dalam kondisi lengkap (semua  percobaan kecuali terlihat dalam Tabel 1) atau 1,2 atau 4 ml / menit untuk antarmuka kondisi (yang percobaan dilaporkan dalam Tabel 1). Diubah dari aCSF dijelaskan dalam teks. R PS-2 dan LM5 pembawa larutan dijelaskan di tempat lain. 

Kelangsungan hidup penilaian

Parameter optimal dalam studi ini sebagai indeks yang disebut kelangsungan hidup adalah rasio K⁺/Na⁺. Tinggi sebuah rasio K⁺/Na⁺ jelas persyaratan untuk kelangsungan hidup neuronal dan aktivitas listrik. Rasio K⁺/Na⁺ telah digunakan untuk evaluasi fungsional kelangsungan hidup dari jaringan otak piaraan astrocytes, jaringan jantung, luka otot, jaringan ginjal dan seluruh ginjal. Setelah penghapusan yang krioprotektan dan reincubasi yang di iris pada aCSF dengan suhu 35 ^oC untuk > 1jam, irisan yang ditempatkan di kelompok dua atau tiga kali dalam 2 ml polyethylene microcentrifuge tabung. Untuk setiap tabung, 0,7 ml isotonic (0,3 M) mannitol dalam air telah ditambahkan ke cucian ions  dari ruang extracellular dari irisan. Kotak yang lain hati-hati telah terganggu oleh tangan untuk 1,5 menit, maka mannitol harus dibuang dan prosedur dapat diulang. Setelah menghapus sisa pelarut, 50 µl  3% w/v Aqueous trichloroacetic acid (TCA) yang telah tambahkan. Konsentrasi K⁺/Na⁺ yang dibaca dalam TCA yg terapung di atas permukaan yang sekurang-kurangnya 24 jam kemudian menggunakan  sebuah flame cahaya meter (Instrumentasi Laboratorium), dan rasio konsentrasi dilaporkan sebagai K⁺/Na^+. Persentase pemulihan dilaporkan

sebagai  100%x(K⁺/Na⁺)dirawat / (K⁺/Na⁺)kontrol.

 Krioprotektan, Perawatan Krioprotektan, dan  Prosedur Vitrification 

Setelah inkubasi awal untuk 60 menit atau lebih pada suhu 35 ^oC di aCSF agar pemulihan dari irisan yang shock dari persiapan, delapan irisan hippocampal yang ditempatkan dalam silinder kecil polyethylene dengan lantai nilon mesh. Irisan yang kemudian terkena krioprotektan oleh perendaman pada dasar silinder ke dalam serangkaian dari pelarut meningkat dan kemudian menurunkan konsentrasi krioprotektan. Sehubungan dengan keenakan dari irisan digunakan untuk mempercepat difusi. Berbagai penambahan krioprotektan protokol yang dievaluasi. Protokol Veg dan VM3 untuk lebih nyata telah dioptimalkan berdasarkan tanggapan dari rasio K⁺/Na⁺ kelangkah perubahan dalam ukuran, durasi, dan suhu, kesulitan yang diberikan secara model teoritis ini luar biasa dan sistem sangat buruk dimengerti. Karena banyaknya studi diperlukan untuk tiba pada penambahan selain optimal dan penghanyutan protokol, kami hanya melaporkan akhir protokol di gunakan untuk setiap krioprotektan dalam sistem belajar. Untuk kejelasan presentasi, akhir protokol ini hasilnya akan diberikan. Mannitol termasuk dalam keluaran cucian di media untuk menghindari kejutan yang bersifat osmosa  dan akan dijelaskan di Hasil. 

Keutamaan rumus krioprotektan adalah Veg dan VM3. Veg terdiri dari  16,84% w/v ethylene glycol, 13,96% w/v formamide dan 24,2% w/v dimethyl sulfoxide (total konsentrasi 55% w/v dari pelarut krioprotektif dari Veg). larutan dari Veg dilaporkan sebagai total konsentrasi mutlak  dari larutan Veg adalah pengenceran dari Veg yang berisi total konsentrasi 25% w/v krioprotektant. VM3 adalah yang pelarut lebih stabil dan lebih maju vitrifikasi yang berisi 22,3% w/v dimethyl sulfoxide, 12,86% w/v formamide, 16,84% w/v ethylene glycol, 7% w/v polyvinylpyrrolidone K12, 1% w/v (akhir konsentrasi) secara berlebihan es blocker dan 1% w/v secara berlebihan Z-1000 es balok. Fisik properti VM3  telah dijelaskan di tempat lain. Veg dan VM3 komersial yang tersedia dari Abad 21.  Obat-obatan, Rancho Cucamonga, CA (www.21cm.com). Setelah pengenalan krioprotektan, vitrifikasi irisan harus ditransfer tiba-tiba, mereka saling  berhubungan, untuk sebuah blok aluminium yang sebagian terbenam dalam nitrogen cair sehingga dingin di atas blok permukaan dengan suhu 130 ^oC. sebagian hydrophobic berat diletakkan di atas kertas blok mencegah adhesi dari sampel ke blok silinder. Penempatan irisan di blok menaikkan suhu lokal blok (sebagai  diukur oleh thermocouple ditempatkan dalam lubang bor-boran ke blok logam) bersuhu 125 ^oC selama 4 menit. Suhu irisan, seperti yang diukur oleh thermocouple, mencapai suhu 125 ^oC saat ini. Pada blok, suhu irisan kembali ke suhu 130 ^oC, yaitu sekitar 3 ^oC di bawah transisi gelas Veg dan suhu 3-4 ^oC di bawah kaca transisi suhu VM3 dalam 4-5 menit. Sebuah tambahan 3-7 menit yang diizinkan pada suhu 130 ^oC sebelum pemanasan ulang. Irisan tidak ditransfer karena pelarutnya diperlukan untuk kelebihan vitrification di suhu 10 ^oC. Thermocouples ditempatkan langsung ke penunjukkan pemanasan irisan dengan suhu rata-rata sekitar 2370 ^oC / min antara TG dan TM.

Prosedur Pembekuan

Krioprotektan telah diperkenalkan dengan menggunakan teknik transfer irisan yang dijelaskan di atas dan pada suhu dijelaskan di bawah ini. Irisan yang kemudian di bekukan dalam kontainer dengan 1 ml polyethylene yang berisi dua irisan dan pelarut 0,3 ml krioprotektan per kontainer. Empat kontainer ditutup dengan Lids yang telah ditempatkan dalam busa floated di kotak yang non-organik cairan beracun seperti hexane yang pada gilirannya telah didinginkan oleh es kering. Setiap masing-masing kontainer di bekukan dengan sebuah tembaga  atau  kawat yang ditembus melalui lantai setiap kontainer dan melalui lantai dari busa kotak, sehingga cepat konduksi panas dari satu titik di dalam larutan krioprotektan ke luar panasnya hilang dan cukup untuk membujuk pendinginan di salah satu tembaga atau kawat. Profil pendinginan diukur selama dua percobaan dengan melibatkan pembekuan 30% v/v gliserin, baik yang memberikan hasil yang sama maupun yang erat. Di percobaan ini, yang diukur dalam suhu sampel yang jatuh di sekitar 2-3 ^oC/menit sampai kristalisasi terjadi di depan mencapai thermocouples dengan suhu dekat -10^oC, yang pada dasarnya adalah sama dengan meleburnya 30% gliserin. Setelah suhu mencapai -10 ^oC, pendinginan yang menjadi nilai konstan yakni 1,2 ^oC/menit sampai mencapai -40 ^oC sehingga terjadi perlambatan sesudahnya. Ketika pendinginan ke bawah diperlukan suhu -20 ^oC, sampel kontainer  telah diizinkan suhu mencapai -50 ^oC sebelum es kering ditransfer ke pendinginan. Pemanasan adalah  pencapaian suhu setelah mentransfer ke kontainer  air mandi dengan suhu 20 ^oC  nilai pemanasan tidak  diukur.

Cahaya dan mikroskopi electron

Irisan kontrol yang  diinkubasi pada suhu 35 ^oC dan kemudian ditransfer ke glutaraldehyde yg digambarkan pada standar embedding, sectioning, dan staining untuk transmisi mikroskopi electron (TEM). Dan lainnya adalah irisan beku dan thawed atau vitrifikasi akan dikembalikan ke kondisi normal pada suhu 35 ^oC seperti yang dijelaskan secara rinci  di bawah ini, kemudian tetap dan diproses untuk TEM sebagai di atas. Contoh paralel dari kelompok yang sama di percobaan yang sama telah dievaluasi oleh rasio K⁺/Na⁺  untuk membolehkan hasil morphological yang akan dikaitan dengan hasil fisiologis. Tebal bagian yang berwarna biru dengan toluidine untuk cahaya mikroskopi.  Semua pekerjaan TEM dilakukan di Harbor-UCLA Departemen Pathologi. Cahaya  fotomikrografi dilakukan di Pengobatan di Abad 21 menggunakan Spot Imaging RT dan kamera video Spot gambar dan pengolahan perangkat lunak (Diagnostik Instrumen, Sterling Heights, MI) untuk memperoleh gambar digital. 

 Uji statistik

Perbedaan antara berarti telah diuji dengan menggunakan Student t test. 

Hasil

Pembekuan luka 

Tanpa kontrol penuh yang terbenam di irisan hippocampal yang ditemukan untuk ratio K⁺/Na⁺ sekitar 1.1-1.5 (Fig. 1, hasil plotted dengan suhu 37 ^oC, berarti rasio bersuhu 1,35 untuk percobaan pertama dan 1,2 detik untuk  percobaan kedua dan ditemukan ratio K⁺/Na⁺ harus responsif terhadap kedua gliserin dan pembekuan dan krioprotektan. Menambahkan 30% v/v gliserin oleh protokol dalam inset menghasilkan moderat penurunan ratio K⁺/Na⁺ menjadi sekitar 0,8 - 1,3 (hasil plotted suhu 10 ^oC). Pembekuan irisan ke suhu -20, -40, atau -79 ^oC di 30% gliserin dan thawed (poin putih) itu sangat terluka, yang mengembalikan ratio K⁺/Na⁺ hanya sekitar 0,3(~27% dari prefreezing  ratio K⁺/Na⁺) pada dua suhu dan 0,2 (~18% dari pra-pembekuan ratio) pada suhu terendah  . Menyimpan irisan beku yang sama dengan protokol di tiga suhu subzero selama 12 jam (poin hitam plotted di bawah 0 ^oC) tidak lebih meningkatkan cedera pada suhu -79 ^oC dan mungkin di  -40 ^oC, namun diakibatkan tambahan  cedera parah di -20 ^oC. Hasil ini tidak diperbaiki oleh penurunan gliserin dengan konsentrasi 10% w/v (recoveries beku - meleleh dari -79 ^oC adalah 13% dari pra-freeze  ratio K⁺/Na⁺) atau mengganti gliserin dengan 20% v/v dimethyl sulfoxide (mencairkan atau membekukan-recoveries dari -79 ^oC adalah 21% dari pra-freeze ratio K⁺/Na⁺) (data rinci tidak ditampilkan). 

Pemeriksaan mikroskopis dari irisan otak tetap setelah pembekuan dan pelelehan dalam 10% gliserin, penghanyutan krioprotektan dan inkubasi pada 35 ^oC selama  ≥ 60 min menunjukkan dua jenis sel utama. Mayoritas adalah dasarnya obliterat (gambar. 2A), dengan proses saraf di daerah-daerah tersebut umumnya  memiliki tampilan vesicles bukan bulat tampak dua dimensi serat. Sebuah minoritas dari sel disimpan dibeberapa integritas struktural namun sangat berkerut dan berubah, dan kemungkinan besar hampir habis (gbr. 2B). Keseluruhan pola yang konsisten dengan kemungkinan intracellular dalam pembekuan proporsi besar neurons menggunakan pemberian prosedur pembekua. Meskipun pemulihan mungkin akan lebih baik  berjalan lambat setelah pembekuan, kami tidak menyelidiki kemungkinan ini sebagai kepentingan utama kami tapi untuk menentukan kemungkinan pelestarian dengan vitrifikasi. 

 Kerusakan  akibat hypothermia dan 25% w/v krioprotektan

Untuk mengurangi kebisaan dari tingginya konsentrasi krioprotektan yang diperlukan untuk vitrification, Temperatur hypothermic yang diperlukan untuk Selain penambahan krioprotektan dan penghanyutannya. Untuk irisan ginjal,  0 ^oC merupakan suhu yang sesuai untuk penambahan dan penghanyutan di sebagian besar kasus. Gambar. 3 menunjukkan hasil 16 kontrol independen percobaan pada efek exposing dari irisan hippocampal tikus suhu 0 ^oC dihadirkan berbagai pelarut yang berbeda dan calon perlindungan agen untuk waktu memvariasikan. Ada eksponen menolak dengan waktu dalam kapasitas untuk memulihkan dan memelihara ratio normal K⁺/Na⁺ setelah penyimpanan di aCSF (triangles) yang parah oleh 2 jam dari eksposur hypothermic dan mencapai penyelesaian atau pendekatan dengan 4,5 jam.

Berdasarkan pengamatan dari rekan kerja Pakhotin  menunjukkan bahwa aspirin dan indomethacin dapat melindungi hippocampal marmot selama penyimpanan dengan dingin berkepanjangan, banyak yang mencoba melakukan untuk mengurangi efek merusak dari eksposur 0 ^oC dengan menggunakan agen ini. Namun, Gambar 3 jelas menunjukkan bahwa baik aspirin (simbol hitam) maupun indomethacin (simbol burik) mempunyai perlindungan berlaku untuk hippocampal tikus. Berdasarkan  yang kita ketahui bahwa masalah pembengkakan sel koloida di bawah kondisi hypothermic, banyak irisan yang disimpan dalam aCSF modifikasi (kotak maCSF), yang terdiri dari aCSF mannitol plus 100 mM, dengan atau tanpa penambahan di atas, tetapi juga intervensi ternyata tidak memiliki pengaruh pada cedera hypothermic. Bagaimanapun juga, dua intervensi lainnya muncul untuk menjadi pelindung. Penambahan 0,8 mM (namun bukan 0,4 mM) larutan asorbic ke aCSF (bergabung triangles abu-abu) tampaknya menaikkan keduanya dari dasar penyimpanan dan pasca ratio K⁺/Na⁺. Memodifikasi aCSF dengan menggantikan 100 mM NaCl dengan 10 mM KCl dan 180 mM mannitol dan mengurangi tingkat kalsium dari 2 ke 0,1 mM nampaknya dapat melindungi irisan dengan baik (lingkaran hitam dan putih). bagaimanapun, penggabungan dua pendekatan ini punya keunggulan baik dalam percobaan satu  (lingkaran abu-abu), dengan alasan yang  tidak jelas. Selain itu, kedua intervensi kelangsungan hidup dibangkitkan tetapi tidak muncul untuk mencegah ratio K⁺/Na⁺ dari penurunan pada tingkat yang sama dengan diamati di aCSF.  ini menunjukkan bahwa cedera yang ditimbulkan oleh 100 min  dari 0 ^oC penyimpanan di maCSF tidak tepat di 10 ^oC.  Lebih jauh, terekspos sampai 25% w/v di Veg 0 ^oC tidak penting untuk menekan racun, 10 ^oC sehingga eksposur sedikit atau tidak ada kerusakan. Menariknya, yang sama Veg  perawatan di 0 ^oC itu jelas merugikan, tetapi kurang melukai daripada eksposur ke maCSF sendiri pada suhu yang sama. Hasil ini menunjukkan adanya luka yang disebabkan oleh eksposur hypothermic yang beroperasi baik di dalam keberadaan dan ketiadaan  dari krioprotektan, tetapi sebagian mitigated 25% w/v Veg. Gliserin serupa tidak memiliki efek perlindungan(data tidak ditampilkan). Tereksposur sampai 25% di Veg  15 ^oC lebih berbahaya daripada eksposur di 10 ^oC (p = 0,0038 oleh t test; data tidak ditampilkan), jadi 10 ^oC terpilih sebagai suhu pilihan untuk tahap awal dari krioprotektan dimuat di protokol lainnya. Kami juga menggunakan variasi konsentrasi mannitol sebagai penyangga di aCSF bersifat osmosa selama penghanyutan krioprotektan di 10 ^oC. Yang berarti ratio K⁺/Na⁺ yang lebih tinggi di 300 mM mannitol lebih baik daripada di 150 atau 450 mM, dan perbedaan antara 300 dan 450 mM yang signifikan (p = 0,012; data tidak ditampilkan).

RPS-2 adalah larutan sederhana yang dikembangkan untuk penyimpanan dingin irisan ginjal kelinci dan seluruh ginjal kelinci. Hal ini mampu menjaga kelangsungan hidup ginjal dari kelinci yang bagian irisannya tidak berubah di 0 ^oC selama 4 hari, sehingga kami memutuskan untuk mencari efektivitas tikus untuk irisan hippocampalnya. Hasil awal kami dengan RPS-2 menghasilkan pemulihan setelah 10 ^oC  eksposur (berarti ratio K⁺/Na⁺ ± 1 SEM, ± 1,05 ± 0,06; krioprotektan tidak hadir) sebesar 109% dari Tanpa irisan kontrol maCSF (0,96 ± 0,04 p = 0,25) dan sebesar 121% dari maCSF kontrol di 10 ^oC (0,87 ± 0,04 p = 0.05), jadi kita mengadopsi RPS-2 untuk percobaan.

 Eksposur ke  ≥ 50% w/v krioprotektan dan vitrifikasi

 Umumnya kelayakan oleh irisan kriopreservasi dengan vitrification pertama kali diuji dengan meningkatkan konsentrasi Veg 50% w/v (Fig. 5). Ketika irisan itu dirawat dengan konsentrasi di aCSF dengan suhu 0 ^oC (tebal-tembok lingkaran), itu sangat merusak, tetapi penggantian aCSF dengan RPS-2 paling menghapuskan cedera ini. Bahkan faktanya, ketika RPS-2 yang digunakan sebagai  pembawa, ada kecenderungan akan mengurangi cedera daripada meningkatkannya oleh penurunan suhu di bawah 10? C (lingkaran abu-abu).

Untuk melengkapi vitrifikasi, ia diperkirakan bahwa 53% w/v Veg adalah konsentrasi  minimum yang diperlukan untuk menjadikan kaca di tingkat pendinginan yang digunakan dalam menghadirkan studi. Meningkatkan konsentrasi sampai 53% di RPS-2 sungguh mengakibatkan cedera lebih  dibandingkan eksposure Veg 50%, K⁺/Na⁺ turun bahkan  pada suhu -10 ^oC ( buka di lengkungan gambar. 5 ). Namun, di sana tidak ada lagi cedera ketika irisan yang jadi dirawat kemudian didinginkan pada suhu 130 ^oC, mendukung memperkirakan  bahwa 53% sudah cukup untuk vitrifikasi.

Karena racun muncul menjadi faktor yang membatasi untuk pemulihan irisan setelah vitrifikasi dengan Veg, kami mengeksplorasi penggunaan VM3 sebagai suatu alternatif larutan vitrifikasi. Karena VM3 berisi  yang X1000 dan Z1000 es balok, kami menggunakan LM5 sebagai pembawa yang baik daripada RPS-2 sejak LM5 lebih memaksimalkan efektivitas es blockers ini.  Kesuksesan penggunaan VM3 diperlukan terutama dalam pengenalan awal protokol dan penghanyutan protokol dan hasil yang tak menentu sampai protokol yang digunakan dalam Percobaan 151 dari Tabel 1 (dan disorot di gambar. 6)  yang digunakan. Namun demikian, beberapa percobaan menunjukkan bahwa pd hakekatnya VM3 tak beracun (pemulihan > 90%  dari rasio K⁺/Na⁺; Tabel 1), dan ketika irisan telah berhasil dirawat dengan vitrikasi VM3, tidak ada perbedaan dalam pemulihan dibandingkan dengan eksposur VM3  sendiri (Tabel 1).

Gambar. 7 menunjukkan ultrastruktur dari lapisan piramidal dan kontrol gyrus dentate vitrifikasi/pemanasan kembali irisan hippocampal tikus setelah pemulihan di aCSF bersuhu 35 ^oC.  Gambar. 7A dan B menunjukkan CA1 sel sel kontrol dan sel granular, masing-masing,  dan gambar. 7C dan D menunjukkan ultrastructure dari wilayah CA4 dan gyrus dentate sel granular setelah vitrifikasi dengan VM3, pemanasan, dan inkubasi 35 ^oC.  Percobaan vitrification yang ditampilkan adalah  contoh kasus terburuk di mana keseluruhan pemulihan dari K+/Na+ hanya 77% dari kontrol (Percobaan 139). Irisan ini menunjukkan campuran sel dan neuropil yang tak terkontrol(gbr. 7C) dan sel yang ditampilkan pada obliterat kental atau morpologi dilihat dalam irisan beku/panas (gbr. 7D), menyatakan tidak memadai terjadinya krioprotektan di sel selanjutnya (untuk menjadikan kaca pada vitrifikasi  atau untuk tetap mencairkan es bebas pada pemanasan). 

Tabel 1.

Kesuksesan Vitrifikasi irisan hippocampal tikus dengan menggunakan VM3^a

No. Percobaan	Kontrol K+/Na+	K+/Na+ after		% dari kontrol K+/Na+
		VM3	Vitrifikasi	VM3	Vitrifikasi
151b	2.71 ± 0.25		2.92 ± 0.18		107.9
152b	2.71 ± 0.19		2.53 ± 0.11		93.3
135c	3.03 ± 0.33		2.75 ± 0.07		90.7
140c	3.41 ± 0.16	3.20 ± 0.14	3.13 ± 0.12	93.7	91.5
123d	2.71 ± 0.23		2.49 ± 0.08		91.9
124	2.63 ± 0.15		2.76 ±0.08e		104.9
124	2.63 ± 0.15		2.51 ±0.43f		95.3

^a Berarti ± 1 SEM. Ratios mutlak yang lebih tinggi daripada di gambar. 1, 3, dan 4 karena penggunaan antarmuka kondisi inkubasi di ruang Oslo 35 ^oC lebih baik daripada pencelupan penuh inkubasi sebelum penilaian K⁺/Na⁺. Dalam semua kasus larutan pembawa adalah LM5.

^b pertama,5langkah tambahan (2, 4, 8, 16, dan 30% w/v)di 10 ^oC dan berlangsung setiap 10 menit. VM3 kemudian ditambahkan pada -10 ^oC (selama 25 menit, dengan perubahan larutan di menit 10 dan 20). Langkah pertama penghanyutan adalah 31% + di -10 ^oC selama 10 menit (+; menandakan adanya 300 mM mannitol). Yang terakhir adalah 7 langkah  penghanyutan adalah 16% +, 8% +, 4% +, + 2%, 1% +, 0 +%, dan 0% w/v di 10 ^oC selama masing-masing 10 menit, dimana 0% larutan LM5.

^c Sama seperti dalam percobaan protokol 151 dan 152, namun langkah pertama penghanyutan adalah 30%, dan 1% + penghanutan diabaikan langkahnya.

^d Sama seperti percobaan protokol 135 dan 140, tetapi irisan diadakan di VM3 selama 30 menit lebih baik daripada selama 25 menit sebelum vitrifikasi,  dan larutan ini tidak berubah selama VM3 dalam keadaan seimbang. 

^e Protokol sama seperti percobaan 123, tetapi irisan diadakan di VM3 selama 20 menit sebelum vitrifikasi. 

^f Protokol sama seperti percobaan 123, tetapi irisan diadakan di VM3 selama 25 menit sebelum vitrifikasi.

Gambar. 8, di sisi lain, dengan membandingkan kontrol dan vitrifikasi/pemanasan sepenuhnya berhasil pada irisan hippocampal tikus  pada tingkat cahaya mikroskopis yang disampaikan dalam struktur skala besar dan kelestarian kelangsungan hidup diperoleh dengan prosedur akhir vitrifikasi. (A) menunjukkan wilayah kontrol porsi CA1 dari lapisan pyramidal.(B) Menampilkan keseluruhan struktur yang diawetkan di irisan bersuhu -130 ^oC dengan vitrifikasi dalam percobaan 151 dari Tabel 1 dan incubasi kemudian di aCSF di 35 ^oC selama > 60 menit. kawasan CA1 ini muncul di Irisan dengan pembesaran tinggi (C), dan wilayah CA3 ditampilkan secara lebih rinci dalam (D). Kedua CA1 dan CA3 bidang vitrifikasi/pemanasan irisan nampaknya sepenuhnya utuh, membenarkan keseluruhan  dalam pemeliharaan nyata (B), dan semua daerah diperiksa juga diawetkan ternyata menjadi sempurna. Hasil Histologik ini berada dalam kesepakatan dengan pengamatan ultrastructural untuk percobaan yang sama dan menunjukkan pelestarian setelah vitrifikasi, pemanasan, hangat dan penetasan pada dasarnya sama yang diamati dalam irisan tanpa kontrol (data tidak ditampilkan).

Pembicaraan/diskusi

Efek dari pembekuan dalam percobaan ini adalah lebih parah dari perkiraan yang didasarkan pada hasil Jensen dkk, yang menggunakan pendinginan yang sama dengan kami untuk membekukan seluruh hippocampi belum dewasa dengan kehilangannya hanya sekitar 35% dari sel granular yang rinci yang dentate gyrus.Kenyataannya, suhu nucleation kami dari -10 ^oC dekat dengan titik cair dari 30% glycerol dan tidak jauh di bawah titik cair 10% gliserin, sehingga luasnya pendinginan sebelum nucleasi dalam percobaan ini ternyata sangat kecil dan biasanya akan tidak diharapkan untuk menghasilkan kemungkinan intracellular tinggi formasi es.  Walaupun demikian, hasil dari morpologi pada gambar. 2 yang bernilai ekstensif pada intracellular formasi es, dan mungkin ini memberikan penolakan yang memantul dari panas dalam metode pendinginan kami. Selain itu, pendinginan yang optimal ditingkat otak belum ditentukan dengan baik dan dapat lebih lambat dari 1^oC/menit karena sebagai contoh, keberadaan  proses syaraf myelinated dan minimal ruang extracellular, keduanya bisa membuat air berjalan lambat seperti tak biasanya. Namun, sebab dari cedera manapun sumbernya dapat hasil yang baik dalam pengembangan  tingkat sel lytic dan jenis gambar dilihat pada gambar. 2A dan B selama periode tantangan metabolis di 35 ^oC, jadi pembekuan intracellular tidak perlu penjelasan secara ekstensif atas  kerusakan yang terlihat. Tetap harus dilihat apakah pembekuan metode bisa cocok dengan hasil yang sangat baik untuk ditampilkan akan didapat dengan vitrifikasi hadir dalam percobaan. Sesuai dengan aturan “80/20” diamati oleh beberapa penyidik ,vitrification cenderung menghasilkan banyak hasil yang lebih baik (pemulihan ~80%) dibandingkan pembekuan (Pemulihan ~20%) untuk sistem contractil atau tulang rawan,  dan mungkin satu berharap situasi ini untuk menerapkan irisan diberikan ke otak mereka. Kami hadir dengan hasil, menampilkan pemulihan dari ~90%, yang konsisten dengan atau bahkan lebih baik daripada harapan berdasarkan  aturan “80/20”. Hasil kami juga menyolok dgn cara yg unggul yang diperoleh dengan mengisolasi sel ketuban hippocampal, yang hanya 12% bertahan di pembekuan 10% dimethyl sulfoxide dan 24 jam kultur yang berlaku.

        Percobaan kami menunjukkan kecenderungan relatif yang cepat dari kemerosotan tikus hippocampal  yang diadakan di irisan 0 ^oC di aCSF. Kecenderungan ini adalah konsisten dengan observasi pada profoundly hypothermic taring yang menunjukkan mata pelajaran yang sangat terbatas jendelan keselamatan bagi otak selama penangkapan hypothermic peredaran darah, model yang dapat meniru slice penyimpanan statis lebih baik daripada model hypothermic perfusion. Rekor untuk periode yang lama dari peredaran darah penangkapan selama hypothermia yang mendalam konsisten berikutnya dengan pemulihan neurological penuh(3 h) telah ditetapkan oleh Haneda dkk. pada tahun 1986 dan belum untuk hari ini. Menurut dia yang diperiksa tahun 2004” periode penangkapan exsanguination jantung selama 120 menit dapat dikembalikan, tetapi keadaan yang biasa adalah sulit untuk dicapai dan kerusakan otak yang signifikan adalah pembedahan mayat temuan”. Tidak seperti Pakhotin dkk.kami tidak, walaupun banyak usaha, dapat memblokir dingin  ini penyimpanan cedera baik menggunakan aspirin atau indomethacin.  Kegagalan ini mungkin karena perbedaan jenis  antara babi Guinea dan tikus. Pakhotin dkk. aspirin hanya digunakan sebagai pretreatment, sedangkan yang kita gunakan sebagai pretreatment, sebagai tambahan larutan hypothermic untuk penyimpanan, sebagai suplemen hadir hanya setelah penyimpanan hypothermic, atau di kombinasi dari cara ini. Dalam kasus ini tidak ada yang konsisten memperlihatkan efek perlindungan, dan kadang-kadang tampaknya efek negatif itu terlihat. Namun, kita lakukan adalah bukti awal untuk mengembangkan sebuah efek perlindungan dari 0,8 mM vitamin C, walaupun tidak untuk perlindungan 0,4 mM oleh vitamin C. Mengubah komposisi dari pembawa tampaknya juga solusi untuk membantu, tetapi apakah mekanisme yang berkaitan dengan perlindungan pengurangan tingkat sodium, kalium dari ketinggian tingkat atau penurunan tingkat kalsium tetap akan ditentukan.

          Apapun mekanisme- mekanismenya, kemampuan pembawa selain untuk memperbaiki aCSF kekuatan pendingin cedera di irisan otak nampaknya penting untuk vitrifikasi irisan otak berhasil, karena menambah dan mengurangi semua kroprotektan di 10 ^oC dan sepertinya di atas suhu itu tidak layak, dan penyimpanan dingin maCSF di aCSF atau di bawah 10 ^oC muncul untuk melanjutkan baik di keberadaan dan ketiadaan krioprotektan.Untungnya, cedera kekuatan dingin dikurangi atau dihapuskan ketika RPS-2 (gambar. 5) atau LM5 (Tabel 1) digunakan sebagai larutan pembawa. Menariknya, Veg gliserin diencerkan  tetapi tidak mampu mengurangi sedikit cedera kekuatan dinginnya. Efek ini tetap tak diterangkan, namun bentuk yang menarik dibandingkan dengan hasil Collins dkk yang menemukan bahwa gliserin dan 0,3 M glyserol dan 0,3 M 1,2-propanediol mampu memperbaiki cedera hypothermic untuk ginjal kelinci. Bahkan bila kekuatan dingin adalah cedera obviat, hasilnya sangat cocok untuk meminta pilihan dengan hati-hati dari kedua  larutan vitrifikasi yang  muncul dan penambahan dan penghanyutan protokol. hasil Terbaik yang kami peroleh dengan  VM3, yang juga nampaknya kurang beracun ke irisan ginjal dari Veg. Kami menggunakan VM3 itu didorong oleh besarnya kenaikan luka ketika melihat tingkat Veg yang dibangkitkan dari 50 sampai 53% w/v. Namun, kita lakukan dengan hati-hati dan tidak mengesampingkan kemungkinan bahwa luka meningkat dapat dicegah dengan melihat akibat dari persimpangan yang bersifat ambang osmosa. Meskipun demikian, larutan VM3 61% w/v yang mampu memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan 50% w/v larutan Veg, yang menyediakan dukungan yang kuat dalam penggunaan VM3 untuk irisan hippocampal. tulang sel persiapan, yang mungkin lebih keras, lebih efektif diawetkan dengan 95% dari kekuatan penuh Veg plus 1% secara berlebihan X-1000. Kami menemukan hal penting yang mengembangkan larutan Dari percobaan pada irisan  ginjal kelinci cortical (VM3) telah berhasil diterapkan pada vitrifikasi dari sistem yang sangat berbeda seperti tikus ova dan irisan \hippocampal tikus. Untuk irisan otak maksimal yang bermanfaat, dan akan bermanfaat jika yang metode sama  dapat digunakan untuk irisan dari berbagai jenis dan dari berbagai wilayah di otak, dan bukti nyata sangat berbeda untuk semua sistem karena itu mendorong rasio K+/Na+ kadar logam yang digunakan dalam percobaan telah didukung tempat lain sebagaian umumnya berlaku untuk kelangsungan hidup diselenggarakannya tes tersebut, dan nampaknya baik  dan cocok untuk seleksi kelangsungan hidup jaringan otak. Sodium potassium dan transportasi merupakan prasyarat untuk aktivitas listrik otak dan mencegah terjadinya keracunan selaput depolarization dan merupakan proses energi dalam jaringan otak. Juga volume sel yang diperlukan untuk pemeliharaan, yang terutama, penting dalam jaringan otak, dan untuk normal sintesis protein dan ia responsif terhadap perubahan dalam selaput permeabilitas, produksi ATP, dan dengan sodium-potassium ion pump ATPase, semua yang penting untuk kelangsungan hidup jaringan otak dan fungsinya. Kehadiran  rasio K+ /Na+ dalam studi yang peka terhadap cedera hypothermic, racun krioprotektan, bersifat cedera osmosa, dan cedera pembekuan, dan ternyata menjadi baik berhubungan dengan integritas morpologi dari hippocampal. Yang hampir lengkap kelestarian morfologi normal bahkan setelah 35 ^oC inkubasi di aCSF untuk periode lama dan mengkonfirmasikan hasil K+/Na+ rasio kadar logam pada dasarnya menunjukkan pemulihan penuh dari kelangsungan hidup dari irisan hippocampal tikus setelah persiapan vitrifikasi dan pemanasan.

 Kesimpulannya, kami memberikan hasil demonstrasi pertama bahwa kelangsungan hidup yang diselenggarakan jaringan otak dewasa dengan jaringan saraf dapat diawetkan dengan baik oleh vitrifikasi. Hasil kami mendukung kemungkinan melestarikan hippocampal untuk bidang farmasi dan irisan fisiologis pengujian baru dan memberikan dukungan untuk kemungkinan dengan sistem saraf untuk aplikasi transplantasi medis. Kelangsungan hidup yang kini telah menunjukkan kelayakan dan kesesuaian untuk melanjutkan pemeriksaan neurophysiological secara rinci pada irisan hippocampal setelah vitrifikasi dan pemanasan dengan tujuan untuk menunjukkan potensi mereka untuk mencari obat psychoactive dan percobaan semacam ini sedang berlangsung.

Ucapan Terima Kasih.

Kita berhutang budi kepada Ibu Kimberly Panizzon dan Dr Roi Ann Wallis (Neuronal Cedera Laboratorium, Sepulveda Veteran’s Administrasi Medical Center, Los Angeles, CA) untuk instruksi berharga persiapan irisan hippocampal dan untuk penerangan diskusi. Kami juga berterima kasih pada Mr. Chris Rasch untuk menyediakan dukungan kunci logistik dan koordinasi untuk proyek. Kami berterima kasih kepada Harbor-UCLA Departemen Pathology dan Institut Neural Cryobiology untuk keperluan layanan administrasi. Sumbangan Pengobatan Abad 21,Veg, VM3, kelangsungan hidup pengujian, mikroskop, desain percobaan dan pengawasan proyek, dan naskah persiapan  yang mendukung proyek ini. Veg dan VM3 adalah larutan milik dari Pengobatan Abad 21. dilindungi oleh paten di beberapa wilayah hukum. Penyelidik ingin menggunakan larutan yang dianjurkan, kontak pengobatan Abad ke 21. Inc (1-909-466-8633; Research@21cm.com).

Komentar :

Mayasari Yamin :

Proses kriopreservasi dengan menggunakan irisan daging dari tikus adalah hal pertama yang diilakukan oleh Yuri Pichugin, Gregory M. Fahy dan Robert Morin meskipun penelitian mengenai kriopreservasi telah lama dilakukan oleh beberapa peneliti lain dengan tujuan memperpanjang hidup gamet dengan teknik penyimpanan pada temperatur rendah seperti -196 ⁰ C sehingga dapat mengurangi aktifitas metabolik dari gamet tersebut yang dapat bertahan lama untuk waktu yang tidak terbatas meski akibat pengaruh radiasi sebelumnya dapat menyebabkan akumulasi kerusakan DNA yang tidak bisa diperbaiki oleh enzim sehingga batas hidup gamet dapat mencapai ribuan tahun.

Penelitian ini menggunakan irisan tikus sebagai sampel yang disimpan pada suhu rendah yang berbeda-beda untuk mengetahui tingkat keberhasilannya dengan menggunakan larutan yang berbeda pula seperti Veg dan VM3. Dari hasil ini, diperoleh bahwa larutan VM3 memberikan hasil terbaik dengan menggunakan sistem vitrifikasi karena  larutan ini termasuk larutan yang lebih stabil dan lebih maju dalam vitrifikasi dan tidak beracun yang berisi 22,3% w/v dimethyl sulfoxide, 12,86% w/v formamide, 16,84% w/v ethylene glycol, 7% w/v polyvinylpyrrolidone K12, 1% w/v (akhir konsentrasi).

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama (klasik) dan teknik baru. Teknik lama didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40oC, sedangkan teknik baru didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada suhu di atas titik beku airPada teknik vitrifikasi, bahan tanaman diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat, pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.

Dengan demikian, dengan teknik kriopreservasi dengan metode vitrifikasi dapat melestarikan keberlangsungn hidup suatu jaringan hidup dalam beberapa periode yang panjang yang nantinya dapat berguna dalam bidang kesehatan dan penggunaan obat-obatan yang dapat membantu kehidupan manusia.

 Ravi Ikhsanul :

Metode pengawetan jaringan dengan teknik kriopreservasi adalah salah satu langkah untuk melestarikan suatu jaringan makhluk hidup. Akan tetapi, dalam kriopreservasi ini sering terjadi kerusakan atau luka yang kebanyakan terjadi pada saat temperatur berada pada kisaran antara 0 – (-40) ⁰C terutama akibat pelepasan panas, fluktuasi pH, kejutan dingin, pembentukan kristal es, pengaruh osmometrik, pengaruh perubahan komposisi dan struktur  membran sel, perubahan ukuran volume sel dan toksitas krioprotektan.

Veg dan VM3 adalah larutan krioprotektan yang digunakan dan diperoleh hasil bahwa VM3 lebih baik dibandingkan larutan Veg. sementara itu, larutan pembawa yang digunakan adalah RPS-2 dan LM5. Meskipun RPS-2 adalah larutan sederhana yang dapat bekerja dengan baik, namun LM5  bekerja lebih baik dengan mengefektifitaskan kerja penghalang es sehingga dapat mengoptimalkan kinerja larutan VM3.

Selama pembekuan dan pelelehan, sel jaringan dapat mengalami kerusakan sebagai akibat dari eksposur bahan tanaman pada suhu rendah, formasi kristal es, sel terdehidrasi, dan formasi radikal bebas. Formasi radikal bebas juga dapat menyebabkan kerusakan sel. Radikal bebas yang dapat terbentuk misalnya radikal hidroksil (OH), superoksida (O2), dan hidrogen peroksida (H2O2).

(Akhirnya, VM3 adalah krioprotektan yang memiliki kemampuan cepat untuk penetrasi ke dalam sel pada saat equilibrasi dan meninggalkan sel pada saat thawing sehingga larutan ini sering digunakan pada proses kriopreservasi.

 Taufiq Hidayat :

Dengan teknik kriopreservasi, pembelahan sel dan proses metabolisme dalam sel, jaringan, atau organ makhluk hidup yang disimpan dapat dihentikan sehingga tidak terjadi modifikasi atau perubahan dalam waktu yang tidak terbatas. Kondisi suhu penyimpanan bahan tanaman dengan teknik kriopreservasi sangat rendah, yaitu -160 hingga -180°C (nitrogen fase uap) bahkan sampai -196°C (nitrogen fase cair). Pada suhu yang sangat rendah, sel-sel tanaman tidak mempunyai aktivitas metabolik dengan viabilitas yang tetap terpelihara sehingga bahan tanaman dapat disimpan dalam jangka waktu yang sangat lama (hingga 20 tahun) tanpa memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang.

Dalam teknik kriopreservasi pada penelitian kriopreservasi dengan irisan hippocampal tikus menggunakan sistem vitrifikasi di mana merupakan fase transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk non kristalin, tembus pandang karena elevasi ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Pada penelitian ini, proses vitrifikasi dilakukan pada tempat inkubasi irisan yaitu aSCF dengan kisaran suhu 0 ^oC – (-40) ^oC dalam waktu yang berbeda-beda pula untuk mengetahui tingkat keberhasilan kriopreservasi dari irisan tikus tersebut.

Sejumlah faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan teknik pembekuan lambat adalah kecepatan pembekuan, jenis dan konsentrasi krioprotektan, (3) suhu akhir pembekuan, dan (4) tipe dan keadaan fisiologis bahan yang akan disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel terlalu terdehidrasi sehingga konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi. Jika pembekuan terlalu cepat maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga terjadi formasi es intraseluler yang bersifat letal.

Teknik kriopreservasi merupakan teknik yang potensial untuk penyimpanan jangka panjang, yaitu menyimpan tanaman ke dalam nitrogen cair yang bersuhu -196oC. Penyimpanan dengan cara tersebut tidak memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga lebih efisien dari segi biaya, waktu, ruang penyimpanan, dan tenaga. Keberhasilan teknik kriopreservasi tidak hanya ditunjukkan dengan kemampuan hidup regenerasi bahan tanaman pascakriopreservasi, namun juga ditentukan oleh tingkat stabilitas genetiknya.

Rangkuman :

Penelitian krioprepervasi pada irisan hippocampal tikus oleh Yuri Pichugin, Gregory M. Fahy dan Robert Morin memberikan hasil demonstrasi pertama bahwa kelangsungan hidup yang diselenggarakan jaringan otak dewasa dengan jaringan saraf dapat diawetkan dengan baik oleh metode vitrifikasi di mana merupakan fase transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk non kristalin, tembus pandang karena elevasi ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan.

Dengan teknik kriopreservasi, pembelahan sel dan proses metabolisme dalam sel, jaringan, atau organ makhluk hidup yang disimpan dapat dihentikan sehingga tidak terjadi modifikasi atau perubahan dalam waktu yang tidak terbatas. Penelitian ini menggunakan irisan tikus sebagai sampel yang disimpan pada suhu rendah yang berbeda-beda untuk mengetahui tingkat keberhasilannya dengan menggunakan larutan yang berbeda pula seperti Veg dan VM3. Dari hasil ini, diperoleh bahwa larutan VM3 memberikan hasil terbaik dengan menggunakan sistem vitrifikasi karena  larutan ini termasuk larutan yang lebih stabil dan lebih maju dalam vitrifikasi dan tidak beracun.

Teknik kriopreservasi merupakan teknik yang potensial untuk penyimpanan jangka panjang, yaitu menyimpan tanaman ke dalam nitrogen cair yang bersuhu -196oC. Hasil penelitian ini mendukung kemungkinan melestarikan sel jaringan untuk bidang farmasi dan pengujian baru dan memberikan dukungan untuk kemungkinan dengan sistem saraf untuk aplikasi transplantasi medis. Penyimpanan dengan cara tersebut tidak memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga lebih efisien dari segi biaya, waktu, ruang penyimpanan, dan tenaga. Keberhasilan teknik kriopreservasi tidak hanya ditunjukkan dengan kemampuan hidup regenerasi bahan tanaman pascakriopreservasi, namun juga ditentukan oleh tingkat stabilitas genetiknya.