Lap. Praktikum : ISOLASI DNA TANAMAN KENTANG IN VITRO DAN ELEKTROFORESIS
Pendahuluan
Pemuliaan tanaman merupakan penerapan suatu metode untuk mengeksploitasi potensi genetik tanaman (Stoskopf et al., 1993) yang bertujuan untuk memaksimumkan hasil pada suatu kondisi lingkungan tertentu dalam suatu usaha budidaya pertanian dengan meminimalkan keluaran (Mayo, 1980) melalui peningkatan hasil, perbaikan kualitas hasil, ketahanan terhadap kendala biotik dan abiotik, pengubahan daur hidup, modifikasi keragaman tanaman serta pengadaptasian pada suatu cara pembudidayaan (Shivanna dan Sawhney, 1997). Keberhasilan usaha pemuliaan tanaman sangat tergantung pada kemampuan mengidentifikasi tetua yang sifatnya akan digabungkan melalui persilangan serta mengenali dan menyeleksi dalam populasi yang bersegeregasi secara efektif. 
Sumber Foto : http://akardanumbi.blogspot.com/2013/01/klasifikasi-tanaman-kentang.html
Pemuliaan dengan metode bioteknologi (teknik DNA rekombinan/rekayasa genetik) menggunakan materi tingkat sel atau jaringan. Metode ini memanfaatkan gen dari spesies lain yang tidak berkerabat (yang tidak dapat disilangkan lewat organ seksual) atau mentransfer gen antar berbagai organisme. Jumlah gen yang direkombinasikan umumnya hanya satu atau beberapa gen, sehingga karakter yang terpengaruh hanya yang dikendalikan oleh gen yang yang ditransfer, sehingga hasil akhirnya dapat diduga. Langkah awal dalam metode ini adalah dengan mengisolasi DNA dari tanaman target.
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. Pemurnian DNA menurut Dale and Malcolm (2002) dapat dilakukan menggunakan :
Percobaan ini betujuan untuk mengisolasi DNA dari tanaman kentang yang mengandung gen chi dan mengetahui konsentrasi DNA total melalui gel elektroforesis dan menentukan dosis pengencerannya
Alat yang digunakan adalah Obeng, Ependoff 1,5 ml, Gunting, Pinset, Pipet dan pipet mikro, Sarung tangan, Scalpel, Laminar Air Flow Cabinet, Mesin Setrifuge dan mesin elektroforesis
Isolasi DNA
Daun kentang sebanyak 0,2 g dipotong kecil-kecil, kemudian masukkan dalam ependoff selanjutnya dimasukkan dalam nitrogen cair untuk membuat daun/batang bersifat crispy biarkan sampai 5 m4nit. Selanjutnya sampel dalam eppendoff digerus dengan menggunakan obeng yang terbuat dari stainles. Sambil tetap digerus ditambahkan buffer extraction sebanyak 250 µl untuk mencegah proses oksidasi. Setelah halus, kembali tambahkan extraction buffer DNA 250 µl dan 500 µl phenol. Larutan phenol dibuat menggunakan campuran chlorophorm dan isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1 (vol/vol) yang kemudian ditambahkan phenol dengan perbandingan 1 : 1. Larutan daun tersebut kemudian dimasukkan ke dalam ependoff ukuran 1,5 ml, tutup dan dibolak-balik perlahan sebanyak 10 kali agar buffer dapat melisis dinding sel, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 – 15 menit.
Larutan daun di dalam ependoff kemudian akan terbagi menjadi 3 lapisan, yaitu supernatan (bagian teratas yang bening), larutan sisa (keruh) dan pelet (kotoran). Supernatan diambil perlahan menggunakan pipet mikro sebanyak ± 300 µl, kemudian tambahkan 0,7 vol isopropanol (210 µl) dan dimasukkan ke dalam ependoff baru, tutup dan bolak-balik sebanyak 10 kali. Selanjutnya disimpan di suhu kamar selama ± 10 menit, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama ± 5 menit. Hasil sentrifuge akan berupa supernatan dan gumpalan DNA berwarna putih (DNA pelet). Supernatan dibuang dengan hati-hati dan cuci menggunakan 300 µl etanol 70%, kemudian sentrifuge kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama ± 1 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang kembali dan cuci menggunakan 300 µl etanol 70%, sentrifuge kembali dan supernatan dibuang. Selanjutnya DNA yang telah bersih dikering anginkan di suhu kamar selama 2-3 menit agar etanol menguap. Setelah DNA kering, tambahkan 2 µl RNAse dan 100 µl MQ. Biarkan disuhu kamar selama ± 10 menit, kemudian dapat disimpan pada suhu – 200C sampai DNA akan digunakan..
Pembuatan gel elektroforesis.
100 ml agarose 1% dicampur dengan 100 ml buffer TAE 1% dan 3 µl ethidium bromide, kemudian ditumpahkan di pencetak gel menggunakan comb yang mempunyai sumur 15.
Pengenceran DNA.
Pengenceran dilakukan berdasarkan bobot molekul hasil amplifikasi elektroforesis, dengan membandingkannya dengan 1 kb ladder. Kemudian DNA yang telah diencerkan dapat disimpan di suhu rendah selama 1 minggu.
Elektroforesis.
Lima µl DNA total dicampur dengan 1 µl blue juice, dicampur sempurna dengan cara dikeluar-masukkan pipet mikro, kemudian isikan ke dalam sumur di gel. Pada gel terpinggir masukkan larutan kb ladder (2 µl kb ladder + 1 µl blue juice), sebagai patokan ukuran DNA. Kemudian diruning di elektroforesis selama 45 menit dengan suhu 70oC. Hasil pita DNA yang diperoleh didokumentasi menggunakan Bio Rad Gel Doc UV.
Ekstraksi DNA
Berdasarkan hasil ekstraksi DNA yang telah dilakukan pada tanaman kentang setiap kelompok mendapatkan hasil yang berbeda-beda. Hal ini dapat dilihat secara fisik dengan kasat mata. DNA yang dihasilkan seperti benang-benang tipis berwarna putih, sedikit banyaknya DNA yang dihasilkan tergantung dari proses ekstraksi yang dilakukan (gambar 1).
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. Pemurnian DNA menurut Dale and Malcolm (2002) dapat dilakukan menggunakan :
- Enzim ribonuklease (Rnase) yang berfungsi untuk mendegradasi RNA
- Ekstraksi phenol-chloroform, untuk menghilangkan protein
- Pencucian menggunakan alkohol, untuk menghilangkan sisa-sisa pheno-chloroform, garam-garaman dan kandungan ion lain
- Sentrifuge dengan kecepatan sedang, untuk memisahkan kotoran sisa degradasi sel.
Percobaan ini betujuan untuk mengisolasi DNA dari tanaman kentang yang mengandung gen chi dan mengetahui konsentrasi DNA total melalui gel elektroforesis dan menentukan dosis pengencerannya
Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah daun tanaman kentang in vitro, Larutan extraction buffer DNA, Larutan phenol, Isopropanol, Etanol 70%, Enzim RNAse, Larutan MQ, gel agarose 1% dan Ethidium Bromide Alat yang digunakan adalah Obeng, Ependoff 1,5 ml, Gunting, Pinset, Pipet dan pipet mikro, Sarung tangan, Scalpel, Laminar Air Flow Cabinet, Mesin Setrifuge dan mesin elektroforesis
Isolasi DNA
Daun kentang sebanyak 0,2 g dipotong kecil-kecil, kemudian masukkan dalam ependoff selanjutnya dimasukkan dalam nitrogen cair untuk membuat daun/batang bersifat crispy biarkan sampai 5 m4nit. Selanjutnya sampel dalam eppendoff digerus dengan menggunakan obeng yang terbuat dari stainles. Sambil tetap digerus ditambahkan buffer extraction sebanyak 250 µl untuk mencegah proses oksidasi. Setelah halus, kembali tambahkan extraction buffer DNA 250 µl dan 500 µl phenol. Larutan phenol dibuat menggunakan campuran chlorophorm dan isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1 (vol/vol) yang kemudian ditambahkan phenol dengan perbandingan 1 : 1. Larutan daun tersebut kemudian dimasukkan ke dalam ependoff ukuran 1,5 ml, tutup dan dibolak-balik perlahan sebanyak 10 kali agar buffer dapat melisis dinding sel, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 – 15 menit.
Larutan daun di dalam ependoff kemudian akan terbagi menjadi 3 lapisan, yaitu supernatan (bagian teratas yang bening), larutan sisa (keruh) dan pelet (kotoran). Supernatan diambil perlahan menggunakan pipet mikro sebanyak ± 300 µl, kemudian tambahkan 0,7 vol isopropanol (210 µl) dan dimasukkan ke dalam ependoff baru, tutup dan bolak-balik sebanyak 10 kali. Selanjutnya disimpan di suhu kamar selama ± 10 menit, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama ± 5 menit. Hasil sentrifuge akan berupa supernatan dan gumpalan DNA berwarna putih (DNA pelet). Supernatan dibuang dengan hati-hati dan cuci menggunakan 300 µl etanol 70%, kemudian sentrifuge kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama ± 1 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang kembali dan cuci menggunakan 300 µl etanol 70%, sentrifuge kembali dan supernatan dibuang. Selanjutnya DNA yang telah bersih dikering anginkan di suhu kamar selama 2-3 menit agar etanol menguap. Setelah DNA kering, tambahkan 2 µl RNAse dan 100 µl MQ. Biarkan disuhu kamar selama ± 10 menit, kemudian dapat disimpan pada suhu – 200C sampai DNA akan digunakan..
Pembuatan gel elektroforesis.
100 ml agarose 1% dicampur dengan 100 ml buffer TAE 1% dan 3 µl ethidium bromide, kemudian ditumpahkan di pencetak gel menggunakan comb yang mempunyai sumur 15.
Pengenceran DNA.
Pengenceran dilakukan berdasarkan bobot molekul hasil amplifikasi elektroforesis, dengan membandingkannya dengan 1 kb ladder. Kemudian DNA yang telah diencerkan dapat disimpan di suhu rendah selama 1 minggu.
Elektroforesis.
Lima µl DNA total dicampur dengan 1 µl blue juice, dicampur sempurna dengan cara dikeluar-masukkan pipet mikro, kemudian isikan ke dalam sumur di gel. Pada gel terpinggir masukkan larutan kb ladder (2 µl kb ladder + 1 µl blue juice), sebagai patokan ukuran DNA. Kemudian diruning di elektroforesis selama 45 menit dengan suhu 70oC. Hasil pita DNA yang diperoleh didokumentasi menggunakan Bio Rad Gel Doc UV.
Hasil dan Pembahasan
Ekstraksi DNA
Berdasarkan hasil ekstraksi DNA yang telah dilakukan pada tanaman kentang setiap kelompok mendapatkan hasil yang berbeda-beda. Hal ini dapat dilihat secara fisik dengan kasat mata. DNA yang dihasilkan seperti benang-benang tipis berwarna putih, sedikit banyaknya DNA yang dihasilkan tergantung dari proses ekstraksi yang dilakukan (gambar 1).
Gambar 1. Penampilan Daun kentang setelah ekstraksi (a) dan DNA daun tanaman kentang setelah di murnikan (b)
Kemurnian DNA hasil isolasi merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam penelitian biologi molekuler, seperti PCR, pembuatan pustaka genom, analisis RAPD, RFLP, dan lain-lain. Kandungan non-DNA tersebut dapat mengganggu proses PCR dan elektroforesis.
Elektroforesis
Hasil elektroforesis (Gambar 2) menunjukkan adanya perbedaan pita DNA yang dihasilkan antara pengenceran 1 µl dan 5 µl. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total tanaman kentang in vitro hasil isolasi tidak begitu baik dan dihasilkan DNA yang masih ada kontaminasi dari protein dan RNA. Kontaminasi ini terlihat dari pita kedua yang tebal menumpuk di bagian bawah gel (komunikasi pribadi, 2007). Dan pita tebal ini sangat jelas terlihat pada pengenceran5 µl.
DNA kentang yang dihasilkan cukup baik (kurang kontaminasi protein dan RNA) terdapat pada kelompok IV, III dan II, sedangkan yang kontaminasinya cukup tinggi adalah kelompok I dan V. DNA tanaman pisang merupakan DNA yang paling murni dihasilkan dari semua tanaman yang diuji, sedang DNA kedondong pada nomor 9 nampak tidak terlihat band (pita).
Gambar 2. Hasil elektroforesis DNA total tanaman kentang, pisang dan kedondong in vitro
Kualitas dan kuantitas DNA yang bervariasi pada setiap kelompok. Perbedaan tersebut terlihat dari panjang fragmen DNA/tebal pita DNA yang dihasilkan, dibandingkan dengan 1-kb ladder sebagai standar fragment. DNA hasil isolasi kelompok I dan II, mempunyai ketebalan pita yang sama. Kelompok III dan V juga mempunyai ketebalan pita yang sama (paling tebal), dan kelompok IV menjadi satu kelompok penghasil pita yang paling tipis untuk tanaman kentang. Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok III, dan V, hasil isolasi DNAnya sangat banyak dan pekat. Namun pada kelompok tersebut terlihat ada smear tebal yang mungkin disebabkan karena adanya potongan fragmen DNA yang lebih pendek. Hal ini mungkin saja terjadi, mengingat DNA hasil isolasi kita memang dipotong menggunakan enzim restriksi. Begitu juga dengan DNA hasil isolasi kontrol. Dan bila kita lihat, semua DNA berada diatas 1-kb-ladder yang berarti bahwa bobot molekul DNA kita melebihi 10 kb. Ketebalan pita hasil amplifikasi elektroforesis digunakan sebagai dasar untuk pengenceran DNA menggunakan penyangga TE. DNA kelompok I dan VII, diencerkan dengan larutan sebanyak 75 ml, kelompok II dan VI diencerkan dengan larutan sebanyak 50 ml, dan kelompok III, IV, dan V diencerkan dengan larutan sebanyak 100 ml.
Kualitas dan kuantitas DNA sebenarnya dapat ditentukan menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi DNA dapat diestimasi menggunakan larutan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (A260), tetapi spektrofotometer kurang sensitif : DNA utas ganda dengan konsentrasi 50 µg/mL akan mempunyai absorbansi 1. Tetapi protein dan phenol dapat mempengaruhi estimasi dan tidak dapat digunakan untuk menguji integritas DNA kita, karena itu sekarang elektroforesis lebih disukai.
Kualitas dan kuantitas DNA sebenarnya dapat ditentukan menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi DNA dapat diestimasi menggunakan larutan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (A260), tetapi spektrofotometer kurang sensitif : DNA utas ganda dengan konsentrasi 50 µg/mL akan mempunyai absorbansi 1. Tetapi protein dan phenol dapat mempengaruhi estimasi dan tidak dapat digunakan untuk menguji integritas DNA kita, karena itu sekarang elektroforesis lebih disukai.
Kesimpulan dan Saran
Kesimpulan
Dari percobaan ini, dapat disimpulkan sebagai berikut :
Dari percobaan ini, dapat disimpulkan sebagai berikut :
- DNA yang dihasilkan setiap kelompok berbeda-beda yang dapat terlihat seperti benang-benang putih sebelum dimurnikan. Setelah dimurnikan terlihat putih dalam bentuk pellet.
- Isolasi DNA tanaman kentang yang telah dilakukan sebagian kelompok menghasilkan DNA yang tidak terkontaminasi oleh (IV, III dan II) ditandai dengan : (1) Pita DNA yang dihasilkan tidak smear dan (2) tidak terdapat pita yang menumpuk di bagian bawah gel dan DNA yang terkontaminasi oleh protein dan RNA yaitu I dan II. DNA pisang merupakan DNA yang paling murni diantara semua DNA tanaman.
- Metode elektroforesis cukup baik untuk memisahkan pita-pita hasil amplifikasi dan pita-pita tersebut dapat digunakan sebagai dasar pengenceran DNA.
Saran
Sebaiknya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya satu jenis tanaman yang diekstraksi secara langsung, tapi ada beberapa tanaman sehingga dapat dibandingkan secara langsung kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan.
Sebaiknya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya satu jenis tanaman yang diekstraksi secara langsung, tapi ada beberapa tanaman sehingga dapat dibandingkan secara langsung kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan.
Daftar Pustaka
Dale, J.W. and Malcolm von Schantz, 2002. From Genes to Genomes. University of Surrey. John Wiley & Sons, Ltd. United of Kingdom.
Donata, 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.
Shivanna K.R., Sawhney V.K. 1997. Pollen biology and pollen biotechnology: an introduction. In Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement (Shivanna and Saehney, eds.). Cambridge University Press.
Stoskopf N.C., Thomes D.T., Christie B.R. 1993. Plant Breeding, Theory and Practice. Westview Press. Oxpord. disukai.
Donata, 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.
Shivanna K.R., Sawhney V.K. 1997. Pollen biology and pollen biotechnology: an introduction. In Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement (Shivanna and Saehney, eds.). Cambridge University Press.
Stoskopf N.C., Thomes D.T., Christie B.R. 1993. Plant Breeding, Theory and Practice. Westview Press. Oxpord. disukai.
Komentar